立式高压灭菌器进行杀菌工作前，需要将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。一般来说每次灭菌前都应该加水。加水不能太少，否则会引起烧干或者爆裂，加水加去离子水或蒸馏水，这样产生的水垢少些，而且锅体不容易被腐蚀。

　　之后放回灭菌器灭菌桶，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。加盖，并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内，再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。

　　用电炉或煤气加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气*排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。当立式高压灭菌器内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间在温度或者压力达到所需时，需要切断电源，停止加热。当温度下降时，再开启电源开始加热，使温度维持在恒定的范围之内。

　　待到灭菌所需时间到后，切断电源或关闭煤气，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，10分钟后取出灭菌物品。如果压力未降到0时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的液体由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。将准备灭菌的培养基及空玻璃器皿用牛皮纸包好，装入锅内套层中，物品放置不宜过多，过挤，锅内应留出三分之一空间。然后盖严锅盖，采用对角式均匀拧紧锅盖上的螺旋，关闭仪器盖上的气阀。